中国合格评定国家认可委员会(CNAS)－CL02《医学实验室质量和能力认可准则》即ISO15189：2012(以下简称新版准则)已于2013年11月22日正式颁布，并于2014年11月1日正式实施。

检验程序性能验证是新版准则的核心技术要素，也是临床实验室质量管理的重要技术要素，本文以新版准则及应用说明为依据，主要参考美国临床和实验室标准协会(Clinical And Laboratory Standards Institute，CLSI)的有关文件，结合自身实践和参加多家实验室现场评审的工作经验，对定量检验程序分析性能验证实验方案设计提出建议。

一、对检验程序性能验证要求的理解

验证是对主要的性能特征进行实验，对于定量检验来说主要是精密度、正确度和可报告范围，某些项目还应包括检出限。新版准则5.5.1.2条款对检验程序的性能验证做出了明确规定^[1]。

具体的要求是：

(1)在进行性能验证前实验室应仔细阅读厂商说明书，获得需要验证的性能特征。

(2)性能验证应由实验室独立完成。

(3)验证的对象是未加修改且性能已确认的检验程序。如罗氏校准品、罗氏生化分析仪、罗氏试剂和检验程序组成的检测系统，厂商已确认了其分析性能，实验室未对检验程序加任何修改；或使用国产试剂的检验程序与特定校准品和生化分析仪形成固定组合，试剂厂商已确认了特定组合条件下检验程序的分析性能，此时实验室进行验证实验即可满足准则要求。如果实验室自由选择试剂、校准品和生化分析仪形成组合，试剂生产厂商没有声明在这一特定组合条件下检验程序的分析性能，在这种条件下应进行分析性能确认试验。

(4)性能验证应在常规应用于临床标本检测前完成。

(5)验证的目的有两个，一是验证是否符合厂商声明的性能，二是验证是否与检验结果的预期用途相关。所谓预期用途是指某项检验用于疾病的筛查或诊断应达到的质量要求，对于定量检验通常用规定的允许总误差来表示，包括允许不精密度和偏倚。

(6)应制定验证程序的SOP文件，并能提供原始实验数据，最终形成性能验证报告，实验室主任或其授权的质量主管或专业组长审核签字，交文档管理员保存。

二、对定量检验程序分析性能验证实验方案设计的建议

1．精密度验证：

精密度验证的样品可以是质控品或新鲜冷冻血清，至少需要两个不同浓度，样品的浓度应尽可能与厂商精密度声明所用的浓度接近，便于比较；若有可能，最好能够选择参考区间两端或医学决定水平处的浓度进行实验，以确定对临床有影响的关键浓度点的性能。

精密度验证实验可采用以下方案之一：

(1)CLSI EP15－A2^[2]或EP15－A3^[3]方案：EP15－A2方案即常规质控在控的条件下，对精密度评价样品每天只做1批，每批重复测定3次，连续测定5天，共获得15个数据，简称3×5实验方案。EP15－A3方案实验要求同EP15－A2，只是每批重复测量5次，连续5天，共获得25个数据，简称5×5实验方案。计算重复性CV和室内CV，并与厂商声明的性能和质量指标进行比较。CV小于或等于厂商声明，精密度性能达到验证。当CV大于厂商声明时，需通过统计学处理比较实验得出的CV与厂商声明有无差异，若没有差异，厂商的性能仍达到验证。

(2)一般方案：实验室首先进行重复性试验，重复性CV满足要求后再用EP5－A2^[4]中的简易方案确定室内CV，即在常规质量控制在控的基础上，把被评价的实验样品当作病人样本，每批只做1次，连续20天，计算均值、标准差和CV，此时的CV反应的是室内不精密度，而实验室和临床最关注的是室内不精密度。EP5－A3^[5]方案实验过程和统计学处理均较复杂，适用于厂商和方法的研究开发者确认分析性能，不建议临床实验室使用。

2.正确度验证：

正确度用偏倚来度量。要想知道偏倚，就必须先知道靶值。靶值可以是参考方法定值或有证标准物质认定值，也可以是能力验证(Proficiency Testing，PT)/室间质量评价(External Quality Assessment，EQA)统计值^[3,5]。

前两者是确定靶值最好的方法，但对于大多数检验项目来说不可能也不现实，PT/EQA统计值是众多实验室剔除离群值后的统计值，如果实验室的检测结果接近PT/EQA的统计值，我们有充足的理由相信实验室的检测结果是正确的，并且近年来国际上也更加强调通过检测具有互通性的PT/EQA样本实现检验结果一致化^[6]。

按照EP9－A3^[7]方案通过常规方法和参考方法比对进行偏倚评估是较好的方法，但国内参考方法仅在极少数实验室使用，目前用于正确度验证不可行。

据此，建议现阶段正确度验证可采用以下方案之一：

(1)有条件的实验室可通过与参考方法比对或检测具有互通性的有证参考物质获得偏倚。

(2)参加CNAS认可的机构或有资质机构组织的正确验证试验或国际上著名的室间比对计划。

(3)利用PT/EQA的靶值进行偏倚评估^[2,3]。使用这一方法的前提是有足够的PT/EQA样本，通常在检测前将PT/EQA样本分装若干份，保证检测PT/EQA样本量，剩余部分冻存；其次是分析物须在一定时间内性能稳定且具有互通性。当定期进行正确度验证，或仪器维修后的正确度验证，或其他原因需要进行正确度验证时，可用其中高低2个浓度水平，每个水平每天测定一批，每批重复测定2次，连续5天，共获得10个测量结果^[2]，或每批重复测定5次，连续5天，共获得25个测量结果^[3]，若测量的均值在验证区间，则候选测量程序的正确度得到验证，如果在验证区间外，则计算测量均值和靶值的偏倚，若偏倚小于用户定义的允许偏倚，正确度验证通过，否则联系厂商寻求帮助^[3]。

(4)利用5个PT/EQA样本的简易方法。对5个PT/EQA样品进行检测，计算每一样品与靶值的相对偏倚，以≤1/2 TEa为标准，若其中4个样品小于此值，另一个样品≤TEa，则正确度得到验证。

需要注意的是，部分实验室通过测定不同批号的校准品进行正确度验证值得商榷，因为体外医疗诊断(in vitro diagnostics，IVD)厂商提供的校准品其溯源性和测量不确定度的所有信息均不可用^[8]。部分实验室通过统计PT/EQA的回报结果计算合格率代替正确度验证是不正确的。

3．可报告范围验证：

可报告范围包括分析测量范围(Analytical Measurement Range，AMR)和临床可报告范围(Clinical Reportable Range，CRR)。AMR是指标本不做任何处理检验程序所能给出准确结果的范围，有时又称测量区间或工作范围，对于两点校准的检验程序又称线性范围。有时临床上常出现超出AMR上限的结果，实验室需将标本稀释后重新测定，测定结果乘以稀释倍数，发出检验报告，这就是临床可报告范围。

实验室可采用CLSI EP6－A方案即线性试验来验证厂商声明的AMR^[9]。但该法需要复杂的统计学处理，实验室有时很难接受，在此推荐两个简单的方法供实验室参考：

(1)基于平均斜率法的原理，选择一个浓度略高于厂商声明的AMR上限的高浓度标本和一个浓度低于厂商声明AMR的低浓度样本按比例混合，或用厂商推荐的稀释液对高浓度样本做倍比稀释，制成5个线性浓度样本，编号分别为①～⑤，以样本号或预期值为横坐标，实测值为纵坐标，在EXCEL软件上绘制坐标图，并计算回归方程Y^{^}＝a＋bX和相关系数r，若r≥0.95，b在0.97～1.03之间，a与"0"无统计学差异，则实验涉及浓度即为AMR。

(2)样本制备同上，每个浓度重复测定3次。在X－Y坐标轴上，以预期值或稀释系数为X轴，以实测值的均值为Y轴，首先绘制通过整个分析范围点与点之间的连线，然后绘制通过尽可能所有点的最佳直线，确保直线通过较低点。不在直线上的浓度点，通常系非线性导致的系统误差。将系统误差与该浓度的预期随机误差(2 s )之和与试验的允许总误差进行比较，从而对该点是否为AMR的上限做出判断^[10]。

CRR的上限常通过最大稀释度验证试验来确定。在AMR范围内选择一个高浓度样本，按厂商推荐的最大稀释度进行稀释，得出该稀释样本的预期值，在检测系统上进行测定，此为实测值，实测值/预期值×100%即为稀释回收率，通常稀释回收率在90%～110%范围内为临床可接受，最大稀释度得到验证^[11]。若回收率达不到要求，则需降低稀释倍数重新试验，直至得出临床可接受的最大稀释度。最大稀释度乘以AMR上限即为CRR的上限。

4．检出限验证：

检出限有多种表示方法，如检出低限、生物检出限、功能灵敏度、空白限、检出限和定量检出限等^[12]。CLSI EP17－A2推荐用空白限、检出限和定量检出限表示检验程序的检出能力^[13]。

目前，厂商试剂盒说明书通常只给出了空白限和检出限，空白限的简单验证方法是对空白样品进行至少20次重复测量，若没有3次测量值超出声明的空白限则验证通过，可直接使用厂商声明的空白限；若厂商没有提供空白限，建议对空白样品重复测量30次，计算第95百分位数(第29.25秩号)的值即为空白限。然后，对具有相当于厂商给定的检出限浓度的样品，在数天内重复测量20次，若低于空白限的结果数不超过3个则验证通过，可以直接使用厂商声明的检出限；若厂商没有给出检出限，则需要选择浓度高于空白限1～4倍的若干份样品，在数天内进行重复测量，至少获得60个测量结果，依据数据的分布情况，采用参数或非参数的方法计算检出限^[12,13]。

确定功能灵敏度的实验方法同检出限，但需分别计算每个浓度样品的日间CV，日间CV达到质量要求(通常为10%或20%)时，样品中所具有的分析浓度即为功能灵敏度^[12]。

三、结语

性能验证仅适用于未加修改且性能已确认了的检验程序，应由实验室独立完成。验证主要有两个目的：一是用实验数据证实检验程序的性能特征是否符合厂商声明，二是实验得出的性能指标是否适合预期用途，即能否达到质量要求。定量检验性能验证的主要指标是精密度、正确度、可报告范围，某些检验项目还应包括检出限。验证实验方案应可能地选择国际公认的方法，但从成本－效益的角度和满足临床要求出发，也可以使用一些简化的方法。